隨著微生物在酵母飼料、酵素蛋白飼料、復(fù)合酶制劑、復(fù)合飼用微生態(tài)制劑(益生素)等的固態(tài)發(fā)酵飼料制品中的應(yīng)用和發(fā)展，一些不利和有害微生物在生產(chǎn)中的污染問題也顯得愈來愈突出，它們嚴(yán)重影響生產(chǎn)的正常運(yùn)行和產(chǎn)品品質(zhì)。無疑，這也是各個(gè)生產(chǎn)單位的重要研究課題之一，尤其是對(duì)于較粗放和敞開式固態(tài)發(fā)酵方式來講，防治雜菌污染實(shí)際上是關(guān)系到整個(gè)發(fā)酵飼料行業(yè)走向正常生產(chǎn)管理軌道，獲得較為純凈的生物制品的非常重要的一個(gè)方面。
    　　筆者認(rèn)為，治菌不如防菌，對(duì)于不利和有害微生物的污染必須采取綜合的防治措施。例如注意清潔衛(wèi)生，選擇性地控制有害微生物生長繁殖的物理化學(xué)環(huán)境，采用必要的防腐(細(xì)菌)和防霉(霉菌)劑，以及嚴(yán)格制定殺菌消毒制度等，這些都是相輔相成的。本文就筆者多年來在國內(nèi)數(shù)家固態(tài)發(fā)酵單位從事技術(shù)指導(dǎo)工作時(shí)在雜菌防治方面的一些淺陋經(jīng)驗(yàn)作一簡單介紹。
    1　微生物污染的來源及其危害
    1.1　空間環(huán)境
    　　發(fā)酵飼料生物制品的生產(chǎn)大多使用曲霉、酵母和一些細(xì)菌作為菌種，它們都是各廠家根據(jù)自己的生產(chǎn)目的而分離篩選出的“需要的”有用微生物菌種。廣義而言自然界還包括不同屬性各種性狀的酵母、霉菌、細(xì)菌、放線菌；還有病毒、立克次氏體、原生動(dòng)物和藻類等，它們有的對(duì)發(fā)酵有益，有的對(duì)發(fā)酵有害甚至是人類的致病菌。不論是有益還是有害，只要不是廠家需要的目的菌，它均屬于“雜菌”范疇。
    　　我們的防治目的主要還是針對(duì)有害菌。微生物都很微小，容易附著在人體或物體上，以人為載體到處移動(dòng)，并從人體或物體上分離到空氣中，附著在灰塵上，到處漂浮。所以，空氣中的雜菌源自于空中的灰塵，車間的灰塵顆粒潔凈度，即象征著無菌程度。
    　　空氣中的雜菌非常復(fù)雜，對(duì)于有嚴(yán)格防菌制度的菌種室而言，空氣中微生物大都為生產(chǎn)中使用的酵母、曲霉孢子或細(xì)菌，雜菌較少。但在操作中稍有不慎，也會(huì)造成一、二、三級(jí)種子污染，進(jìn)而在四級(jí)種子敞開培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)為大量污染而無法使用。污染菌大多為高溫桿菌、黑根霉等，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)異味，造成停產(chǎn)待種?？諝猸h(huán)境中雜菌對(duì)成品發(fā)酵的影響相對(duì)較小。
    1.2　原材料污染源
    　　在各類油料餅粕、麥麩、玉米粉、食品及釀造行業(yè)下腳料、魚粉中，含有大量的霉菌孢子，多為黑根霉，在魚粉中更是含有沙門氏菌和綠膿桿菌等致病性芽孢桿菌，在較潮濕的環(huán)境中及含水較高的培養(yǎng)料上生長極快，原料中又以麥麩的根霉孢子含量最多。當(dāng)用魚粉作原料之一時(shí)，一定要在121℃的溫度下滅菌30min以上才能保證生產(chǎn)安全。
    　　生產(chǎn)中若滅菌不充分，或經(jīng)常在菌種室區(qū)域搬運(yùn)及使用麥麩等原料，極易造成制種階段污染根霉，在使用100%麥麩作制種培養(yǎng)基時(shí)，嚴(yán)重的造成里外皆霉，防不勝防。在使用淺盤法生產(chǎn)菌種時(shí)，料厚若高于8cm，則易造成物料內(nèi)層的厭氧和高溫環(huán)境，滋生大量桿菌，并產(chǎn)生異味。當(dāng)然，這也與上一級(jí)種子質(zhì)量優(yōu)劣有關(guān)。
    1.3　人體污染源
    　　在按嚴(yán)格無菌制度操作的菌種室和有無菌處理要求的場所，發(fā)生污染的最大可能原因是由人體上的微生物混入空氣中而造成的，在1d內(nèi)人體可以釋放出幾億個(gè)菌，尤以頭發(fā)中最多。
    　　人體主要微生物分布為：頭發(fā)和頭皮中有許多葡萄球菌，棒狀桿菌及其它革蘭氏陽性細(xì)菌；手掌上常有葡萄球菌和芽孢桿菌等；口中常檢出有葡萄球菌、鏈球菌、棒狀桿菌等；耳、鼻、眼中有葡萄球菌、芽孢桿菌、棒狀桿菌及革蘭氏陽性細(xì)菌等；人的皮膚表面的菌亦很多；衣服及物品上微生物的類型及數(shù)量則更多；另外還附著有大量霉菌孢子。由于每個(gè)人所保持的清潔度不同，其數(shù)量有很大差別。
    　　在種子制作階段，這些微生物很容易進(jìn)入種子中造成污染。葡萄球菌是一種極難控制的有害細(xì)菌，由于某些球細(xì)菌的生長繁殖條件與耐滲透壓的生產(chǎn)用酵母相似，故而常常在發(fā)酵階段大量繁殖，使產(chǎn)品出現(xiàn)極為不爽的氣味，嚴(yán)重降低產(chǎn)品品質(zhì)。實(shí)際上在PH為4.5～5.5的高蛋白基料及高滲水平上的固態(tài)發(fā)酵常出現(xiàn)的污染是球細(xì)菌，而極少污染霉菌和桿狀細(xì)菌。人體則是造成球細(xì)菌污染的根本和主要原因。
    1.4　其它污染源
    　　許多污染源也是相互關(guān)聯(lián)的，例如空氣中的雜菌最難控制，它們來源于物料、物品及人的活動(dòng)，并漂浮于空氣中。所以最有效的防范措施在于嚴(yán)格的衛(wèi)生制度和行為約束制度，然后才是嚴(yán)格的空間消毒殺菌和原料滅菌規(guī)程，并注意生產(chǎn)車間的周圍環(huán)境。
    2　污染的檢測(cè)
    2.1　用沉降法檢測(cè)空氣中微生物
    　　2.1.1操作過程　制備好固體培養(yǎng)基平板，當(dāng)需要測(cè)定空間某處雜菌污染情況時(shí)，打開培養(yǎng)皿蓋，暴露一定時(shí)間；蓋上培養(yǎng)皿蓋，于適宜溫度下，倒置培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察比較菌落的多少，鏡檢菌落的類別。
    　　2.1.2注意事項(xiàng)　要分別制備細(xì)菌、霉菌等培養(yǎng)基平板，分開測(cè)定；暴露的時(shí)間根據(jù)具體情況而定，空氣干凈則暴露時(shí)間長一些，反之時(shí)間短一些；此法只能說明空氣中雜菌污染的大致情況，不能計(jì)算空氣雜菌密度；測(cè)定的高度、部位視具體情況而定，在同一房間中，最 好分開放置幾個(gè)培養(yǎng)皿。
    2.2　接種法計(jì)算空氣中雜菌密度
    　　準(zhǔn)備好一定體積的無菌水，將一定體積的空氣全部通過無菌水，微生物則被阻留在水中，用一定量的該水接種到培養(yǎng)皿中，進(jìn)行培養(yǎng)，觀察長菌情況，將數(shù)得的菌落數(shù)進(jìn)行換算，即可得單位體積空氣中的雜菌數(shù)。
    2.3　原料、人體、污染源中雜菌定性觀察
    　　可采取簡單的取樣、定量定容、無菌地接種到平板上，培養(yǎng)并進(jìn)行觀察鑒別和計(jì)數(shù)。
    2.4　生產(chǎn)中雜菌檢測(cè)觀察結(jié)論(見表1)
    表1　雜菌污染情況及根本來源(或“宿主”)　%
    
    污染物 黑根霉 葡萄球菌 桿狀細(xì)菌 其它 合計(jì)
    一級(jí)種子 5 80 14 1 100
    二級(jí)種子 10 80 8 2 100
    三級(jí)種子 80 15 4 1 100
    四級(jí)種子 90 5 4 1 100
    發(fā)酵生產(chǎn) 10 80 8 2 100
    “宿主” 原料 人體 人體、原料 人體、原料 　
    注：表中百分比指該雜菌可能造成污染的程度，并非絕對(duì)污染。其它指其它霉菌?！八拗鳌敝改畴s菌至少90%以上來源于該污染源。
    　　對(duì)于空氣而言，一般只是一種將雜菌從人體和物料上污染到生產(chǎn)物料中的中間介質(zhì)，不是根本的“宿主”，故表中并未列出。
    　　實(shí)踐證明，對(duì)于最終發(fā)酵產(chǎn)品而言，好氣性球細(xì)菌等比較難以控制，許多廠家由于管理不善及技術(shù)不過關(guān)，使產(chǎn)品細(xì)菌含量嚴(yán)重超標(biāo)。
    3　雜菌預(yù)防措施
    　　本文僅就關(guān)鍵的制種階段的雜菌防治作一簡單的介紹，由表1可知，制種階段易污染黑根霉，嚴(yán)重時(shí)使制種無法進(jìn)行下去，嚴(yán)重影響菌種活力和質(zhì)量。另外還必須注意葡萄球菌污染，盡管在制種時(shí)它不是主要污染菌，但進(jìn)入發(fā)酵階段則可發(fā)展為主要污染菌。球細(xì)菌與桿狀細(xì)菌的防治與操作人員的無菌觀念和責(zé)任心有很大關(guān)系。
    3.1　菌種生產(chǎn)工藝條件
    　　即培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)環(huán)境條件，這是首先應(yīng)考慮到的。微生物的污染是防不勝防的，盡管有最 先進(jìn)的設(shè)備，也不能絕對(duì)防止它進(jìn)入培養(yǎng)料中。所以制定一個(gè)具有高度選擇性的生產(chǎn)工藝條件是上策，更何況我們都習(xí)慣于那些比較粗放簡單的生產(chǎn)方式。
    　　3.1.1配方　生產(chǎn)中切忌采用營養(yǎng)過于豐富或碳氮比極高的培養(yǎng)基配方，在二、三、四級(jí)種子階段采用具有馴導(dǎo)作用的配方是很有效的。例如在以菜粕為主原料的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)中，在種子配方中可采用在二、三、四級(jí)種子培養(yǎng)基配方中逐步放大菜粕用量的方法，同時(shí)配合其它配方技術(shù)，既可有效地防止雜菌污染，又可得到較高的細(xì)胞含量。同時(shí)，種子也得到了三步馴導(dǎo)，有利于發(fā)酵生產(chǎn)。
    　　過于豐富的培養(yǎng)基的第一個(gè)弊端在于細(xì)胞生長過旺過快，加上空氣擴(kuò)散速度跟不上，使物料內(nèi)部產(chǎn)生高溫可達(dá)50℃和缺氧環(huán)境，使厭氣性高溫桿菌和球菌大量繁殖，產(chǎn)生不良?xì)馕?。其次，在濕度較高的底部會(huì)生長成片的黑根霉菌塊。筆者認(rèn)為，以油料餅粕、淀粉質(zhì)原料復(fù)配，使基料蛋白含量在25%～35%為宜，同時(shí)加入1.5%～5%的無機(jī)鹽(根據(jù)本廠菌種滲透壓耐性而定)，來調(diào)節(jié)滲透壓，抑制雜菌生長，必要時(shí)加入鹽酸溶液以調(diào)節(jié)PH值到5.0左右。
    　　3.1.2物料水分和環(huán)境濕度　水分對(duì)微生物來說有非常重要的意義，各種營養(yǎng)成分必須先溶解于水，才能被細(xì)胞利用。需水量的多少，隨微生物種類而不同，一般來說水分的需要程度是細(xì)菌＞酵母＞霉菌。保持環(huán)境的相對(duì)濕度也是很重要的，基質(zhì)中的水分，特別是表面部分的含水量，隨空氣中的濕度變化而呈正相關(guān)變化。與微生物的發(fā)育有密切關(guān)系的，不是絕對(duì)水分含量(%)，而是水份活性(簡寫為AW)，基質(zhì)中含的水分不能全部為微生物所利用，其中一部分得溶解基質(zhì)的成分，因此與可溶性物質(zhì)少的基質(zhì)相比，可溶性物質(zhì)多的基質(zhì)水分活性就低，微生物的繁殖就相對(duì)地不容易?？扇苄晕镔|(zhì)一旦溶于水，水的一部分就捕獲這種物質(zhì)，水的蒸汽壓就會(huì)降低，假如純水的水蒸汽壓為P0(25℃)，基質(zhì)中水的蒸汽壓為P(25℃)，則這種基質(zhì)的水分活性AW＝P/P0。
    　　控制基質(zhì)AW對(duì)于控制根霉的污染具有很重要的意義，主發(fā)酵酵母菌往往是耐高滲的，所以有意識(shí)地在基料中復(fù)配一定的無機(jī)鹽類，適度地降低水分活性，提高水中滲透壓，可有效地抑制根霉菌的生長，同時(shí)又可使基質(zhì)保持較高的絕對(duì)含水量，并且不會(huì)在培養(yǎng)過程中較快的干涸。另一方面，在后序的生產(chǎn)發(fā)酵中，往往加水比僅1∶0.52～0.62，水活性AW更低，故而在三、四級(jí)種子培養(yǎng)料中加入適當(dāng)鹽類，更有馴導(dǎo)的作用，大大縮短發(fā)酵延滯期。
    　　從表2、表3可知，黑根霉較容易控制并有效地抑制其生長。但對(duì)好氣條件下的葡萄球菌來說，其對(duì)AW的要求接近于曲霉菌，某些葡萄球菌甚至可耐0.82以下的水活性，它們會(huì)在種子擴(kuò)大培養(yǎng)中累積生長并潛伏下來，在連續(xù)通風(fēng)發(fā)酵生產(chǎn)中表現(xiàn)出較嚴(yán)重的污染。
    表2　某些鹽類飽和溶液所顯示的水分活性(25℃)普通微生物的發(fā)育最低水分活性(AW)
    
    鹽類 AW 鹽類 AW 微生物 發(fā)育的最低AW
    KCl 0.842 K2G2O7 0.980 普通細(xì)菌 0.90
    NaCl 0.752 KNO3 0.924 普通酵母 0.88
    KBr 0.807 BaCl2 0.901 普通霉菌 0.80
    MgCl2 0.330 SrCl 0.708 好鹽細(xì)菌 ≤0.75
    NaNO3 0.737 Mg(NO3)2 0.528 耐干滲霉菌 0.65
    K2CO3 0.427 K(C2H3O2) 0.224 耐滲酵母 0.61
    表3　一些生產(chǎn)用菌及污染微生物的發(fā)育及AW的關(guān)系
    
    微生物 發(fā)育最低AW 微生物 發(fā)育最低AW
    肉毒桿菌 0.98 玫瑰式小球菌 0.90
    蠟樣芽孢桿菌 0.97 嫌氣金黃色葡萄球菌 0.90
    沙門氏菌 0.95 好氣金黃色葡萄球菌 0.87
    綠膿極毛桿菌 0.94 黑曲霉 0.86
    黑根霉 0.93 灰綠曲霉 0.81
    大腸桿菌 0.92 扣囊擬內(nèi)孢霉 0.769
    八疊球菌屬 0.91 白地霉 0.842
    　
    　　空氣中濕度以70%～80%為宜，過高易滋生霉菌、細(xì)菌，過低則基質(zhì)水分散失過快，不利于種子生長。
    　　3.1.3溫度與供氣　料溫不得高于40℃，否則桿狀細(xì)菌會(huì)大量繁殖，持續(xù)高溫，將使種子過早衰老死亡，得到的種子質(zhì)量、活力不高，發(fā)酵延滯期較長。料溫最 好控制在32℃左右，對(duì)于5cm厚的三級(jí)種子淺盤培養(yǎng)而言，宜在培養(yǎng)10h后，斷掉培養(yǎng)室內(nèi)熱源。僅靠料溫及種子本身生長產(chǎn)熱維持培養(yǎng)，22h可成熟出料，該法是針對(duì)密封性較好的培養(yǎng)室而言的，夏天則應(yīng)注意降溫。對(duì)于培養(yǎng)量較大的四級(jí)種子生產(chǎn)，則空間應(yīng)注意通風(fēng)換氣，并且易于控制溫濕度為宜。
    　　3.1.4酸堿度　微生物的生長繁殖受環(huán)境酸堿度(PH值)的影響，與溫度條件一樣，各種微生物有自己最適的PH范圍。一般來說，細(xì)菌尤其是有害細(xì)菌的最適PH范圍是中性偏堿(PH＝7～8)，大多數(shù)酵母和霉菌的最適PH范圍是弱酸性(即PH＝4～6)，與細(xì)菌相比，酵母和霉菌生長的PH范圍較廣些。微生物在超過PH的最適范圍外的環(huán)境中，生長便受到抑制，甚至發(fā)育受阻，因此，控制基質(zhì)的PH，就可控制微生物的繁殖和活動(dòng)。例如調(diào)節(jié)基料PH在4.0～5.5之間，可控制且遏止有害細(xì)菌的生長，而不影響酵母、曲霉的生長。另外，有些發(fā)酵設(shè)施也可采用酸處理的方法來預(yù)防雜菌生長，如湖南有家私營企業(yè)，采用竹扁上竹架的大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)酶制劑產(chǎn)品，日產(chǎn)0.5t，年創(chuàng)利潤80多萬元，但細(xì)菌產(chǎn)氨味問題一直沒有得到解決。盡管采取了各種遏止方法都無濟(jì)于事，成為數(shù)年來的一塊心病。后來發(fā)現(xiàn)，是由于竹扁太多，勞動(dòng)強(qiáng)度大，在清洗和消毒竹扁時(shí)，不能完全殺死竹扁上殘留的細(xì)菌。既然無法全部殺死，則最 好的方法是抑制，于是在竹扁清洗后，用1%鹽酸溶液配合消毒水對(duì)竹扁進(jìn)行噴霧處理，曬干后再用于發(fā)酵，就從根本上解決了長時(shí)間發(fā)酵(72h)隱藏的產(chǎn)氨味問題。
    　　以上各種工藝條件對(duì)于制種來講，應(yīng)是相輔相成的，總之，各種微生物都有自己最適宜的生長條件。因此只要我們有目的地控制這些條件，人為地破壞雜菌的生長條件，就可以防止或減少雜菌的污染。
    3.2　加強(qiáng)原料管理，車間合理布置、嚴(yán)格滅菌操作
    　　黑根霉等來源于各類原料，必須加強(qiáng)原料管理。原料必須嚴(yán)格滅菌才能進(jìn)行制種，原料配合和預(yù)處理車間必須遠(yuǎn)離或隔離于制種車間，杜絕一切使原料在車間內(nèi)頻繁搬動(dòng)的操作，不使用發(fā)霉結(jié)塊和變質(zhì)的原料，使用的水要干凈清潔。
    3.3　注意環(huán)境衛(wèi)生及個(gè)人衛(wèi)生
    　　充實(shí)必要的自動(dòng)化設(shè)備，盡量做到不用手工操作；墻壁天花板的涂料中應(yīng)配合高效低毒的防霉劑以防止發(fā)霉；建立工作服的清潔衛(wèi)生和消毒滅菌制度。對(duì)于無菌室、菌種室及培養(yǎng)室建立定期的空間、地面等消毒滅菌制度。
    　　注意車間的通風(fēng)、除塵、干燥和消毒，盡可能減少和杜絕微生物的污染源。
    　　注意個(gè)人衛(wèi)生，在無菌室或其它要求無菌處理的場所，必須采取完全防止從人體釋出微生物的措施。
    　　實(shí)驗(yàn)和操作后，要及時(shí)處理現(xiàn)場，尤其是殘留培養(yǎng)基和殘留菌種，要及時(shí)地進(jìn)行清洗和滅菌處理。
    　　在抓好管理的同時(shí)，要對(duì)職工經(jīng)常進(jìn)行培訓(xùn)，培養(yǎng)無菌意識(shí)，建立無菌概念，有效的防止雜菌污染。