1　范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了微生物肥料使用菌種安全性分級(jí)目錄、不同菌種及產(chǎn)品選擇毒理學(xué)試驗(yàn)的原則、程序、試驗(yàn)方法和結(jié)果評(píng)價(jià)方法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于中華人民共和國境內(nèi)生產(chǎn)、銷售的微生物肥料。
2　規(guī)范性引用文件
下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵(lì)根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB 15193.3-2003   急性毒性試驗(yàn)
GB/T 4789.28-2003  食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)染色法、培養(yǎng)基和試劑
3　術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1　
半數(shù)致死量  median lethal dose,LD50
是經(jīng)口給予受試物后，預(yù)期能夠引起動(dòng)物死亡率為50%的單一受試物劑量，該劑量為經(jīng)過統(tǒng)計(jì)得出的估計(jì)值。其單位是每千克體重所攝入受試物質(zhì)的毫克數(shù)、克數(shù)或毫升數(shù)，即mg/kg體重、g/kg體重或mL/kg體重。
4　選擇毒理學(xué)試驗(yàn)的原則
4.1　生產(chǎn)用菌種
微生物肥料生產(chǎn)用菌種分為四級(jí)管理，其安全分級(jí)目錄見附錄A。未列入附錄A中的菌種，除根瘤菌和乳桿菌(Lactobacillus）外，其余均需做毒理學(xué)試驗(yàn)。
4.1.1  第一級(jí)（A.1）為免作毒理學(xué)試驗(yàn)的菌種。
4.1.2  第二級(jí)（A.2）為需做急性毒性試驗(yàn)的菌種。
4.1.3  第三級(jí)（A.3）為需做致病性試驗(yàn)的菌種。
4.1.4  第四級(jí)（A.4）為禁用菌種。
4.2  產(chǎn)品
4.2.1  除有機(jī)物料腐熟劑以外的固體微生物接種劑類產(chǎn)品均免做毒理學(xué)試驗(yàn)。
4.2.2  復(fù)合微生物肥料、生物有機(jī)肥和液體劑型微生物接種劑等需做急性毒性試驗(yàn)。
5　毒理學(xué)試驗(yàn)程序
5.1  菌種毒理學(xué)試驗(yàn)程序
5.1.1  應(yīng)提供微生物肥料生產(chǎn)用菌種的鑒定資料，包括屬及種的拉丁文學(xué)名和中文譯名、形態(tài)、生理生化特性及鑒定依據(jù)、功能評(píng)價(jià)等資料。
5.1.2  根據(jù)產(chǎn)品所含菌種的鑒定資料，依據(jù)附錄A之規(guī)定，確定菌種安全級(jí)別、是否做毒理學(xué)試驗(yàn)及毒理學(xué)檢測(cè)項(xiàng)目。
5.1.3  對(duì)于需要做毒理學(xué)試驗(yàn)的菌種，生產(chǎn)者需提供試驗(yàn)用純菌種斜面，經(jīng)復(fù)核確認(rèn)與該菌種鑒定資料相符且無雜菌污染后，進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)。
5.2  產(chǎn)品毒理學(xué)程序
需對(duì)送檢產(chǎn)品進(jìn)行菌種和載體物料的真實(shí)性確認(rèn)后，進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)。
6　試驗(yàn)方法
6.1 受試物的準(zhǔn)備
6.1.1  菌種受試物
將試驗(yàn)菌種接種于適宜的培養(yǎng)基中，在適宜的條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，用生理鹽水調(diào)整菌液濃度至2.0×108～2.0×109cfu/mL，該溶液為菌種受試物。
6.1.2  產(chǎn)品受試物
固體產(chǎn)品根據(jù)試驗(yàn)要求，配制所需濃度，溶劑首選去離子水，也可選用羧甲基纖維素、明膠、淀粉等。液體產(chǎn)品不可稀釋，直接使用。
6.2  急性毒性試驗(yàn)
按GB 15193.3-2003執(zhí)行。
6.3  致病性試驗(yàn)
致病性試驗(yàn)包括以下項(xiàng)目。
6.3.1  急性毒性試驗(yàn)
方法同5.2。
6.3.2  一次破損皮膚刺激試驗(yàn)
6.3.2.1  目的
檢測(cè)受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮膚的刺激/腐蝕作用和強(qiáng)度。
6.3.2.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
每次實(shí)驗(yàn)至少需要3只皮膚完好的白色健康家兔或豚鼠。
6.3.2.3  操作程序
a)涂受試物前，將家兔或豚鼠背部脊柱兩側(cè)的毛去掉，去毛范圍約2.5cm×2.5cm，用75%酒精清潔、消毒暴露皮膚，待酒精揮發(fā)后，用滅菌刀片或注射針頭分別在兩塊皮區(qū)內(nèi)劃一個(gè)“＃”形的破損傷口。注意皮膚破損僅達(dá)表皮，不要傷及真皮。
b)將受試物0.5mL直接滴于破損皮膚上，或滴于同樣大小的2層～4層紗布上并敷貼于破損皮膚表面，然后用一層無刺激塑料膜或油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定。另一側(cè)去毛破損皮膚作為空白對(duì)照（或溶劑對(duì)照），敷貼時(shí)間為4h。試驗(yàn)結(jié)束后，用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物。
c)分別于去除受試物后1h、24h和48h觀察皮膚局部反應(yīng)，并按表1進(jìn)行刺激反應(yīng)評(píng)分。注意鑒別感染和原發(fā)性刺激反應(yīng)的區(qū)別，若有感染可疑，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)測(cè)試。
6.3.2.4  評(píng)價(jià)規(guī)定
在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，按照表1對(duì)動(dòng)物的皮膚紅斑與水腫形成情況進(jìn)行評(píng)分，并按時(shí)間點(diǎn)將3只動(dòng)物的評(píng)分相加，除以動(dòng)物數(shù)，獲得不同時(shí)間點(diǎn)的皮膚刺激反應(yīng)積分均值（刺激指數(shù)）。取其中最高皮膚刺激指數(shù)，按表2評(píng)定該受試物對(duì)動(dòng)物皮膚刺激強(qiáng)度的級(jí)別。

　
表1  皮膚刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2  皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)

6.3.3  溶血試驗(yàn)
6.3.3.1  目的
檢測(cè)受試物是否具有溶血特性。
6.3.3.2  操作程序
用無菌棉拭子蘸取菌種受試物, 以蛇形線接種于血瓊脂平板(按GB/T4789.28-2003中4.6規(guī)定),置36℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 24h后觀察有無溶血環(huán)產(chǎn)生。同時(shí)用已知陽性菌株金黃色葡萄球菌等作為對(duì)照。
6.3.3.3  試驗(yàn)結(jié)果
    菌落周圍有溶血環(huán)的，則溶血試驗(yàn)陽性；否則為陰性。
6.3.4  抗菌藥物敏感試驗(yàn)
質(zhì)控菌株可選用大腸桿菌ATCC25922等標(biāo)準(zhǔn)菌株。
6.3.4.1  目的
檢測(cè)受試物對(duì)抗生素的敏感性強(qiáng)度。
6.3.4.2  試驗(yàn)用抗生素
可選用頭孢哌酮（CFP）、四環(huán)素（TE）、頭孢唑啉（CZ）、鏈霉素（S）、俐特靈（FR）、環(huán)丙沙星（CIP）、復(fù)方新諾明（SXT）、氯霉素（C）、氨芐青霉素（AM）、慶大霉素（GM）、強(qiáng)力霉素（DO）、丁胺卡那霉素（AN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、多西環(huán)素(DO)、依諾沙星(ENO)、阿米卡星(AN)等中的幾種。
6.3.4.3  操作程序
a) 用無菌棉拭子將受試物均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板表面，共涂抹3次。每涂抹1次，平板應(yīng)轉(zhuǎn)動(dòng)
60o，最后將棉拭子繞平板邊緣涂抹一周。蓋好平皿,置室溫干燥5min。
b）用無菌棉拭子蘸取濃度為2.0×108～2.0×109cfu/mL質(zhì)控菌株菌懸液，均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板表面，具體方法同上，作為對(duì)照試驗(yàn)。
c)以無菌操作取出抗生素紙片分別貼在涂有受試物和質(zhì)控菌株菌懸液的平板培養(yǎng)基表面，每個(gè)平板放4個(gè)紙片。然后將平板置于36℃±1℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h后觀察抗生素紙片周圍有無抑菌環(huán)，量取并記錄其直徑（包括紙片直徑）大小，單位mm。試驗(yàn)應(yīng)做3個(gè)平行，取其均值。
d)質(zhì)控菌抑菌環(huán)應(yīng)均在質(zhì)控范圍內(nèi)，說明試驗(yàn)方法準(zhǔn)確可靠，否則試驗(yàn)無效。
6.3.5  急性腹腔注射致病性試驗(yàn)
6.3.5.1  目的
檢測(cè)受試物的急性致病性。
6.3.5.2  試驗(yàn)動(dòng)物
清潔級(jí)健康成年小鼠，體重18～20g。
6.3.5.3  操作程序
a）選健康成年小鼠40只,體重18～20g，雌、雄各半，劑量為500mg/kgBW，按0.1mL/10gBW經(jīng)腹腔注射受試物。
b）于腹腔注射后第3d、7d分別取存活的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌、雄各5只解剖，并做大體病理學(xué)觀察。
c)腹腔注射后第14d將剩余實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死、解剖并做大體病理學(xué)觀察。
6.3.5.4  結(jié)果觀察、評(píng)價(jià)
根據(jù)試驗(yàn)周期內(nèi)動(dòng)物有無死亡及出現(xiàn)的中毒體癥、大體病理學(xué)觀察及病理組織學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)病變的程度進(jìn)行分級(jí)判定（見表3）。
表3 急性致病性判定標(biāo)準(zhǔn)

6.3.6   急性眼刺激試驗(yàn)
6.3.6 .1  目的
檢測(cè)受試物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物眼睛的急性刺激和腐蝕作用。
6.3.6.2  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
3只家兔，試驗(yàn)前檢查家兔雙眼，有異常者不能用于試驗(yàn)。
6.3.6.3  操作程序
a）吸取受試物0.1mL,滴入家兔一側(cè)眼結(jié)膜囊內(nèi)，另一側(cè)眼以生理鹽水作為正常對(duì)照。
b）滴受試物后，將眼被動(dòng)閉合4s,30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼觀察家兔眼結(jié)膜、虹膜和角膜的損傷與恢復(fù)情況。如果72h內(nèi)未出現(xiàn)刺激反應(yīng)，或第7d或第14d，眼睛刺激反應(yīng)完全恢復(fù)，即可提前終止試驗(yàn)。必要時(shí)，用2%熒光素鈉溶液或裂隙燈、放大鏡檢查角膜及虹膜變化。
6.3.6.4  評(píng)價(jià)規(guī)定
按表4對(duì)家兔眼角膜、虹膜和結(jié)膜的急性刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分，并分別計(jì)算每只動(dòng)物在三個(gè)不同觀察時(shí)間（24h、48h和72h）角膜損害、虹膜損害、結(jié)膜充血和結(jié)膜水腫四方面的“平均評(píng)分”（即每只動(dòng)物的24h、48h和72h評(píng)分之和除以觀察數(shù)3）。分別以動(dòng)物眼角膜、虹膜和結(jié)膜充血、水腫的平均評(píng)分和恢復(fù)時(shí)間進(jìn)行評(píng)分，按表5或表6眼刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定受試物對(duì)眼睛的刺激強(qiáng)度。
表4  急性眼刺激反應(yīng)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表5  眼刺激反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

表6   眼刺激性反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

7　結(jié)果評(píng)價(jià)
凡毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)為有毒的產(chǎn)品，不得生產(chǎn)和銷售；有毒或致病性試驗(yàn)結(jié)果不符合的菌種,均不得作為微生物肥料生產(chǎn)用菌種。
7.1  急性毒性試驗(yàn)
根據(jù)半數(shù)致死量（LD50）數(shù)值,判定受試物的毒性分級(jí), 半數(shù)致死量(LD50)劑量分級(jí)按GB 15193.3-2003附錄D執(zhí)行，凡LD50>5000mg/kgBW的，可通過，即該菌種可作為生產(chǎn)用菌種或該產(chǎn)品可進(jìn)行生產(chǎn)、銷售。
7.2  致病性試驗(yàn)
7.2.1 急性毒性試驗(yàn)
結(jié)果判定同6.1。
7.2.2 一次破損皮膚刺激試驗(yàn)
如結(jié)果為無刺激或僅具輕度刺激作用，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
7.2.3 溶血試驗(yàn)
溶血試驗(yàn)結(jié)果為陰性的，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
7.2.4 抗菌藥物敏感試驗(yàn)
受試菌株必須對(duì)兩種以上的抗生素敏感；否則，應(yīng)放棄使用。
7.2.5 急性腹腔注射致病性試驗(yàn)
結(jié)果為無急性致病性可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
7.2.6 急性眼刺激試驗(yàn)
結(jié)果對(duì)眼無刺激性或具有輕刺激性的，可通過；否則，應(yīng)放棄使用。
　
附錄A
（規(guī)范性附錄）
菌種安全分級(jí)目錄
A.1  第一級(jí)：免作毒理學(xué)試驗(yàn)的菌種
A.1.1  根瘤菌類                       
Azorhizobium caulinodans                           莖瘤固氮根瘤菌（田菁（莖瘤）根瘤菌）
Bradyrhizobium elkanii                               埃氏慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）
Bradyrhizobium japonicum                          日本慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）
Bradyrhizobium liaoningense                       遼寧慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）
Mesorhizobium huakuii                                  華癸中生根瘤菌（紫云英）
Mesorhizobium loti                                        百脈根中生根瘤菌
Rhizobium etli                                              埃特里根瘤菌（菜豆）
Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli       豌豆根瘤菌（菜豆生物型）
Rhizobium leguminosarum biovar trifolii         豌豆根瘤菌（三葉草生物型）
Rhizobium leguminosarum biovar viceae          豌豆根瘤菌（蠶豆生物型）
Sinorhizobium fredii                                   費(fèi)氏中華根瘤菌（快生大豆根瘤菌）
Sinorhizobium meliloti                                苜蓿中華根瘤菌
還包括尚未確定種名的，從一些豆科植物根瘤內(nèi)分離、純化、鑒定、回接、篩選后在原宿主植物結(jié)瘤、固氮良好的根瘤菌，如花生、綠豆、沙打旺根瘤菌等。
A.1.2  自生及聯(lián)合固氮微生物類         
Azospirillum lipoferum                                  生脂固氮螺菌
Azospirillum brasilense                                  巴西固氮螺菌
Azotobacter beijgerinckii                                拜氏固氮菌
Azotobacter chroococcum                               褐球（圓褐）固氮菌
Azotobacter vinelandii                                   棕色固氮菌
Azotobacter paspali                                       雀稗固氮菌
Beijerinckia indica                                        印度貝氏固氮菌
A.1.3  光合細(xì)菌類                     
Rhodobacter capsulatus                                  莢膜紅細(xì)菌
Rhodobacter sphaeroides                                類球紅細(xì)菌(球形紅桿菌)
Rhodopseudomonas acidophila                        嗜酸紅假單胞菌
Rhodopseudomonas gelatinosa                        膠質(zhì)紅假單胞菌
Rhodopseudomonas globiformis                      球形紅假單胞菌
Rhodopseudomonas palustris                           沼澤紅假單胞菌
Rhodopseudomonas rutila                              血色紅假單胞菌
Rhodopseudomonas sulfidophila                     嗜硫紅假單胞菌
Rhodopseudomonas viridis                             綠色紅假單胞菌
Rhodospirillum fulvum                                  黃褐紅螺菌
Rhodospirillum rubrum                                  深紅紅螺菌
Rhodospirillum salinarium                             鹽場(chǎng)紅螺菌
Rubrivivax gelatinosus                                  膠狀紅環(huán)菌（膠狀紅長命菌）
A.1.4  分解磷鉀化合物細(xì)菌類           
Bacillus amyloliquefaciens                              液化淀粉芽孢桿菌
Bacillus laterosporus                                      側(cè)孢芽孢桿菌
Bacillus licheniformis                                    地衣芽孢桿菌
Bacillus megaterium                                      巨大芽孢桿菌
Bacillus mucilaginosus                                  膠胨樣芽孢桿菌
Bacillus subtilis                                            枯草芽孢桿菌
Bacillus thuringiensis                                     蘇云金芽孢桿菌
Thiobacillus thiooxidans                                氧化硫硫桿菌
A.1.5  促生細(xì)菌類                     
Paenibacillus azotofixans                               固氮類芽孢桿菌
Paenibacillus polymyxa                                 多粘類芽孢桿菌
A.1.6  酵母菌類                       
Candida guillermondii                                    季也蒙假絲酵母
Candida membranaefaciens                            膜醭假絲酵母
Candida tropicalis                                         熱帶假絲酵母
Candida utilis                                               產(chǎn)朊假絲酵母
Endomycopsis fibuliger                                  扣囊擬內(nèi)孢霉
Pichia farinosa                                     粉狀畢赤酵母
Pichia membranaefaciens                               膜醭畢赤酵母
Saccharomyces cerevisiae                               釀酒酵母
Rhodotorula rubra                                        深紅酵母
A.1.7  放線菌類                       
Frankia sp.                                                  弗蘭氏克菌（固氮放線菌）
Streptomyces chingyangensis                          涇陽鏈霉菌
Streptomyces microflavus                                細(xì)黃鏈霉菌
A.1.8  AM真菌類                      
Glomus mosseae                                            摩西球囊霉
A.1.9  其它                           
Lactobacillus parabuchner                              類布氏乳桿菌
Lactobacillus acidophilus                               嗜酸乳桿菌
Lactobacillus bulgaricus                                 保加利亞乳桿菌
Lactobacillus casei                                         干酪乳桿菌
Lactobacillus delbruecki                                 德氏乳桿菌
Lactobacillus lactis                                        乳酸乳桿菌
Lactobacillus plantarum                                 植物乳桿菌
Pediococcus pentosaceus                                戊糖片球菌
Streptococcus lactis                                    乳酸鏈球菌
Streptococcus thermophilus                       嗜熱鏈球菌
A.2  第二級(jí)：需做急性毒性（LD50）試驗(yàn)的菌種
Arthrobacter aurescens                                   金黃節(jié)桿菌
Aspergillus candidus Link                               亮白曲霉
Aspergillus niger                                            黑曲霉
Aspergillus oryzae                                          米曲霉
Aspergillus penicillioides Speg                        帚狀曲霉
Aspergillus wentii Wehmer                             溫特曲霉
Eurotium chevalieri Mangin                            謝瓦散囊菌
Bacillus brevis(Brevibacillus brevis)                短芽孢桿菌
Bacillus circulans                                          環(huán)狀芽孢桿菌
Bacillus coagulans                                        凝結(jié)芽孢桿菌
Bacillus pumilu                                             短小芽孢桿菌
Bacillus sphaericus                                        球形芽孢桿菌
Brevibacterium sp.                                         短桿菌
Burkholderia fungorum                                  真菌伯克霍爾德氏菌
Chaetomium  cochliodes                                 螺卷毛殼
Chaetomium trilaterale                             三側(cè)毛殼
Clostridium pasteurianum                          巴斯德梭菌
Geobacillus stearothermophilus                        嗜熱脂肪地芽孢桿菌
(Bacillus stearothermophilus)                         
Geotrichum candidum                                    白地霉
Nocardia sp.                                                 諾卡氏菌
Nocardiopsis sp.                                            擬諾卡氏菌
Paenibacillus macerans                                  浸麻類芽孢桿菌  
Penicillium citreonigrum                                黃暗青霉
Penicillium citrinum                                       桔青霉
Penicillium frenguentans                                ?，F(xiàn)青霉
Penicillium glabcum                                      光孢青霉
Pseudomonas fluorescens                                熒光假單胞菌
Promicromonospora citrea                              檸檬原小單胞菌
Pseudomonas putida                                      惡臭假單胞菌
Pseudomonas stutzeri                                     施氏假單胞菌
Pseudomonas vesicularis                                泡囊假單胞菌
Rhizopus oryzae                                             米根霉
Sphingobacterium multivorum                         多食鞘氨醇桿菌
Sporotrichum thermophile                               嗜熱側(cè)孢霉
Streptomyces albidoflavus                               微白黃鏈霉菌
Streptomyces fradiae                                      弗氏鏈霉菌
streptomyces griseospiralis                              灰旋鏈霉菌
Trichoderma harzianum                           哈茨木霉
Trichoderma koningii                                     康寧木霉
Trichoderma viride                                        綠色木霉
A.3  第三級(jí)：需做致病性試驗(yàn)的菌種
Acinetobacter calcoaceticus                            乙酸鈣不動(dòng)桿菌
Acinetobacter baumannii                                鮑氏不動(dòng)桿菌
Alcaligenes denitrificans                                反硝化產(chǎn)堿菌
Alcaligenes faecalis                                       糞產(chǎn)堿菌
Alcaligenes xylosoxidans                                木糖氧化產(chǎn)堿菌
Bacillus cereus                                              蠟樣芽孢桿菌
Enterobacter agglomerans                              成團(tuán)腸桿菌
Enterobacter cloacae                                     陰溝腸桿菌
Enterobacter gergoviae                                  日勾維腸桿菌
Pseudomonas alcaligenes                                產(chǎn)堿假單胞菌
Pseudomonas diminuta                                   缺陷假單胞菌
Proteus sp.                                                    變形菌
A.4  第四級(jí)：禁用菌種
Erwinia sp.                                                  歐文氏菌
Klebsiella pneumoniae                                   肺炎克雷伯氏菌
Klebsiella oxytoca                                         產(chǎn)酸克雷伯氏菌
Pseudomonas aeruginosa                               銅綠假單胞菌